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安阳叶绿素荧光成像仪在农业植物胁迫测定上的特点及应用

发表于:2020-11-5 9:05:00 来源:http://ay.chongshengyiqi.com/news494243.html

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在作物发育的早期阶段及时发现病虫害、病菌感染或杂草可以在很大程度上降低农药的使用率,但在实际操作中却困难重重,因为在世界范围内,经常会出现一些对农药具有抗性的杂草、病菌或害虫。因此,如何选择合适的农药并取得理想的效果同样是非常困难的。如何应对这些挑战,亟需使用新的传感器,在田间条件下快速,准确的检测早期植物胁迫,指导农业生产。


本文重点介绍了一种基于安阳叶绿素荧光成像测量的传感器。该传感器可以通过Fv/Fm量化除草剂和病原体对植物产生的胁迫叶绿素荧光与热量构成了捕获光能中损失掉的部分,这部分无效激发能的比例取决于光系统II的状态。在暗处理的叶片中(光系统II完全开放),荧光发射比例约为吸收光的2%到10%。1931年,Kautsky和Hirsch就已经观察到了叶绿素荧光强度与光合作用状态之间的关系,因此叶绿素荧光可以作为光合作用的有效探针。在叶绿素荧光测量过程中,叶片突然曝露在强光下,首先会表现为荧光产率快速上升,然后在几分钟内缓慢下降。最初荧光上升可以反映了PS II反应中心从完全开放到完全关闭的转变,即从可以进行光化学反应的状态到不能进行光化学反应的状态。在PS II中,光能捕获由捕光天线来完成,光驱动的电荷分离由反应中心完成。发生电荷分离的反应中心将电子通过脱镁叶绿素传递至QA,QA是与PS II反应中心结合的质体醌分子。在QA?存在的情况下,PS II反应中心关闭,因为它不能利用激发能进行稳定的电荷分离,多余的激发能由捕光天线,发射荧光(和热)。QA通过把电子传递给QB被迅速再氧化。非常高的光强度(饱和脉冲)会导致QB被完全还原,此时,QA-不能再氧化,也就是说PS II反应中心完全关闭


荧光发射和光化学淬灭激发能的分配解释了为什么在黑暗中(即PS II反应中心完全开放的情况下)测量最小荧光(Fo),而在反应中心完全关闭时测量最大荧光(Fm)的原因。Kitajima和Butler在1975年已经推导出荧光比率参数Fv/Fm(其中Fv = Fm - Fo)与PS II的最大光化学效率有关。迄今为止,Fv/Fm参数在植物胁迫研究中一直发挥着重要作用。


使用叶绿素荧光技术分析除草剂对植物胁迫早有报道,也曾引起了业界的广泛关注。因为使用除草剂是常规农业中最有效,最常用的杂草控制策略。理想的除草剂会选择性地消灭杂草,但不会伤害农作物。然而现实与理想总是有差距的,即便是选择性极强的除草剂也可能会危害作物。除了除草本身以外,不利的天气条件、施用时机不当、错误的频率、混合物的其他有效成分以及辅助剂的添加等因素也会影响除草剂的选择性,可能还会造成意想不到的严重后果。因此,除草剂的选择性不足或使用不当,不可避免地会造成作物生物量减少和产量损失。另外,除草剂的选择性还取决于农作物的品种:例如,植物体内活性成分排毒能力的提高可以降低除草剂的毒性效应。所以,量化除草剂对作物和杂草的胁迫对评估除草剂的有效性至关重要。


回到叶绿素荧光测量,最初,Fv/Fm测量仅限于个别专业能力非常强的实验室,后来,随着脉冲振幅调制荧光仪(PAM)的商业化,测量Fv/Fm和其他荧光参数逐渐成为了一种常见的光合作用分析方法。叶绿素荧光测量具有原位,无损等特点被广泛接受和认可。再后来,为了实现田间叶绿素荧光测量,现场直接检测植物受到的胁迫,商业化的PAM荧光仪制造商对现有PAM成像设备的硬件和软件进行了升级。本研究的目的旨在介绍PAM成像技术作为一种快速、非侵入性的工具来分析除草剂和病原菌胁迫,并鉴定田间抗除草剂杂草,为今后作物栽培管理决策提供一种有效的工具


—— PAM传感器的硬件 ——


本文介绍的PAM传感器是由德国WALZ公司M系列IMAGING-PAM叶绿素荧光成像仪的MINI版改制该设备由防水平板电脑,多功能控制单元和测量单元组成,平板电脑和多控制装置安装在带提手的铝制框架上。测量单元由1/3英寸CCD相机(640×480像素)和K7-MIN定焦镜头(F1.4/f = 16 mm)组成,并在相机镜头周围布置一个LED阵列。该LED阵列由12个蓝色(470 nm)LED(图1b)组成,它们既提供脉冲调制的激发光又可以提供饱和脉冲,该饱和脉冲驱动荧光从Fo上升到Fm。LED装有滤波片,以防止其微弱的长波光进入检测器。一个长通滤光片安装在相机前面,仅透射荧光辐射并阻隔 640 nm以下波长的光。捕获的荧光在相机中被数字化。多功能控制单元包含一个微控制器和一个可充电锂电池(14.4 V / 6 Ah),为相机和LED供电。为了使植物在黑暗条件下适应Fo测量,设计了暗适应盒。暗适应盒的底座为铝框,植物位于铝框的上方(图1 c)。框架的四角可以用钉子将其牢固地固定在地面上。暗适应盒的上部可以放置在底座上,它是一个由深拉塑料片制成的截断金字塔状结构。盒子的顶部可以用滑片密封,以防光线进入,它表面的框可以完美契合MINI-IMAGING-PAM的测量头 (图1 d)。在地面上35mm处安装了一个尼龙网,以保持在相机的焦距范围尽可能的覆盖植物。测量面积为24×32 mm2。在带有关闭滑盖的暗适应盒中对植物进行至少20分钟的暗处理。将测量单元放置在盒子上之后,将滑块打开,以便可以测量仍然处于暗适应的植物,获得准确的荧光参数。



图1 新型PAM成像系统的硬件和附件概述

a平板电脑(1)、控制单元(2)和测量单元(3),b带蓝色LED和中央相机镜头的测量头,c铝框架与目标植物,d暗适应盒。


—— PAM荧光和饱和脉冲分析 ——


PAM荧光成像传感器仅测量由μs测量光闪烁激发的荧光。这些测量闪光的有效强度非常弱,通常低于1μmol/m2s。因此几乎所有PS II反应中心都处于开放状态。在这样的条件下,测量Fo荧光。为了关闭PS II反应中心并因此引发Fm荧光,PAM成像传感器施加了几百毫秒8200μmol·m-2·s-1(波长470nm)的高强度脉冲 。Fv/Fm是对初级PS II光化学的最大量子产率的度量。在健康状态下,大多数高等植物的数值在0.78至0.84之间。较低的值表示PS II光化学性能下降。这称为光抑制,通常在胁迫条件下在植物中观察到。


—— PAM传感器的软件 ——


PAM荧光成像传感器的软件是基于IMAGING-PAM荧光计的ImagingGigE。对于同一样品的Fo和Fm级荧光,该软件可采集640×480像素的图像。Fv/Fm的图像是由像素计算创建的。使用色标将Fv/Fm的原始灰度图像转换为彩色信息。在HSL(色调、饱和度、明度)色空间圆柱的轴线上逐步增加角度位置,使S和L保持不变,从而产生了色标度。图2显示了繁缕(Stellaria media)受胁迫和未受胁迫的Fv/Fm彩色荧光图像。未受胁迫的植株呈蓝色,表明Fv/Fm约为0.8(图2b),而受胁迫植株的Fv/Fm约为0.4(图2a)。



图2 受胁迫和未受胁迫繁缕的Fv / Fm彩色荧光图像


该软件允许将字符表示的荧光参数等数据导出为纯文本(.csv文件),Fo、Fm和Fv/Fm的图片导出为TIFF和JPG图像。数据处理遵循良好的实验室惯例,并且不允许更改原始数据。在Windows 操作系统的电脑上,可以脱机模式运行软件并对数据进行后处理。对于后处理,可以手动选择感兴趣的区域(AO I),可以同时选择多个区域。对于每个定义的感兴趣区域,Fv/Fm值的算术平均值由软件自动计算。根据样品的大小,一个区域可以代表整株植物、各种叶片或仅叶片部分。后处理还允许设置Fv/Fm像素值的全局上限和下限阈值。由于背景荧光通常低于目标植物的Fo荧光,因此阈值的正确设置会遮挡背景荧光,因此将其从Fv/Fm计算中排除。对于野外使用,ImagingGigE软件的数据管理进行了修改,以允许将连续的Fv/Fm测量结果存储在单个文件中。原始软件不考虑Fv/Fm值接近零的区域。该软件属性旨在区分光合作用物质和非光合作用物质。然而,强除草剂作用会使部分叶片的Fv/Fm降低到接近于零的水平,结果导致这些区域被忽略,叶片Fv/Fm的计算偏向受影响较小的叶片区域。以草叶为例,通过实现一种基于叶子形状的自动形态学叶子模式识别软件,克服了这一潜在的困难,仅记录叶片像素的Fv/Fm值。对于阔叶杂草,由于目前可用的数据仍然有限,模式识别仍处于发展阶段。


为了增加测量数据的可追踪性,系统加载了一个全球导航卫星系统(GNSS)模块,直接将调查区域的坐标写入数据文件。此外,该平板相机还可用于对植物样品进行条形码扫描,将样品直接分配到测量中。测量完成后,数据文件可以通过Wi-Fi或LAN连接到互联网自动上传到云服务器上。将数据上传到云服务器的目的仅仅是存档和共享原始数据。基于云的自动后处理程序目前不可用。


—— 应用 ——


1.  除草剂对杂草的胁迫


监测除草剂对杂草的药效在作物生产中起着重要作用。越早发现除草剂作用不足,就可以越早采取进一步的除草措施。对于抗除草剂的杂草,在早期发现后及时采取应对措施,可以降低抗性种群增长的风险。因此,本文提出了一种评估除草剂效能的策略,包括对除草剂抗性杂草的检测


步骤1:通过比较经除草剂处理过和未经除草剂处理过的大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides Huds.)Fv/Fm的平均值,在种群水平上估算杂草敏感性 (EXP1, EXP2, EXP3,表1)

步骤2:对易感单株和抗性单株的Fv/Fm值进行后期分离,考察两种样型Fv/Fm值的差异(EXP4,表1)。

步骤3:创建了一个分类器,根据单个植物的Fv/Fm值,将其划分为“敏感”和“抗性”两类。理想情况下,这个分类器可以在没有对照组的情况下识别除草剂抗性(EXP5,表1)。

表1 实验概述


表2 通过目测和荧光测量评估乙酰乳酸合酶抑制剂和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂处理大穗看麦娘后种群抗性的混淆矩阵(S为敏感,R为抗性)


表3 除草剂用于研究繁缕除草剂诱导胁迫实验(SC悬浮聚集,SG水溶性颗粒)



2. 除草剂对作物的胁迫


为了研究常用的除草剂对甜菜(Beta vulgaris spp. vulgaris)和大豆(Glycine max L.) 中杂草的防治对作物品种的植物毒性,Weber等(2017)研究了9个甜菜和7个大豆品种。


表4 敏感性(S)和抗性(R)繁缕光系统II的最大量子产量Fv/Fm


表5 玉米除草剂胁迫的实验处理



3. 杂草竞争和真菌感染



图3 除草剂处理后玉米的光系统II的最大光化学量子产率(Fv/Fm)的变化


图4 冬小麦光系统II的最大光化学量子产量(Fv/Fm)(240株/m2)

C =未经处理的对照; W =与野芥(Sinapis arvensis L)竞争的冬小麦(200株/m2);M=患白粉病的冬小麦; M + W =与野芥竞争的冬小麦(200株/m2) +患白粉病冬小麦; DAT=接种白粉病后的天数。具有相同小写字母的条形图在统计学上没有差异。


—— 展望 ——


为适应更多应用,安阳叶绿素荧光成像系统设计的结构紧凑,超便携。虽然原理有些复杂,需要一定的专业知识来执行正确的测量和评估收集的数据的有效性,但这并不影响它成为科学家或高级顾问使用的强大工具。因为它的应用领域可以很广泛,比如综合杂草管理、育种和农用化学品的开发,除此之外它还可以用于识别早期的生物或非生物胁迫,可以用于对杂草抗除草剂检测器的性能优化,可作为可靠除草剂药效评估的时效性工具。在育种中,该传感器可以帮助育种家选择抗旱性最强的品种,而在农药生产方面,可以在田间评估除草剂、罐药、佐剂和植物补剂对植物健康状况的影响等等。


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